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Pipetting Hot and Cold
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작성자 : 사이언스21 | 조회: 5 | 날짜: 2019-04-08 15:31:43

예리하고 관찰력 있는 과학자들이라면 온도가 낮은 시료를 피펫팅할 경우 팁을 교체하면 항상 기대치보다 더 많은 양이 흡입된다는 것을 알아냈을 것이다. 하지만 이상하게도 팁을 교체하지 않은 상태에서 두 번째부터는 기대치보다 적은 부피가 흡입되는 양상을 보인다. 온도가 높거나 낮은 시료를 피펫팅 하는 경우는 연구실에서는 통상적이므로 이러한 이상 현상은 중요하게 다룰 수밖에 없다. DNA 추출이나 증폭과 같은 대다수 응용에서 시료를 4℃로 유지해야 하는 반면 실험 기구들은 실온상태(일반적으로 약 20℃)로 방치되고 있다. 이와는 반대로 37℃에서 인큐베이션 시킨 후 온도가 높은 상태의 시료를 피펫팅하면 위와는 반대의 결과가 나타나게 되는데 이러한 현상은 시료가 사실상 실온에 도달할 때까지 기다라는 것 외에는 검증할 만한 다른 방법이 없다. 위에서 설명한 이상 현상은 온도가 공기치환 방식 피펫(Airdisplacement pipette)에 끼치는 영향에 기인하는 것이다.


전자 또는 수동식 공기치환 피펫은 홀더(Shaft) 내부의 피스톤이 위아래로 움직이면서 작동을 하게 된다. 공기쿠션(Air cushion)이라고 일컫는 일정 수준의 공기가 피스톤과 액체 시료 사이에 유지된다. 다른 기체와 같이 피스톤과 시료 사이의 공기쿠션도 압력, 온도, 그리고 부피로 정의될 수 있다. 이러한 변수들은 상호 관계가 있다. 따라서 공기치환 피펫의 정확성(계통오차)과 정밀성(확률오차)은 공기쿠션 부피 변화와 직접적인 관련이 있게 되고 팁 내부 온도가 변하면 결과적으로 부피 또한 달라진다.


Gilson은 시료 온도가 피펫 성능에 끼치는 영향에 대한 연구를 착수했다. 우리는 결과를 보고하고 현 상황에서 해결책을 주고자 한다. 이 작업은 프랑스 COFRAC(Committe for Accreditation)에 의하여 인준된 우리의 ISO 17025 인증 실험실에서 시행되었다.


국제표준 기구의 온도에 대한 고찰
표준화를 위한 국제기구는 피펫 보정을 15-30℃(정밀성 ±0.5℃)사이에서 실행해야 한다고 언급했기 때문에 시료 온도가 피펫 기능에 영향을 주는 것을 인정한 셈이다. 게다가 보정 과정에 사용된 기구, 소모품, 그리고 액체도 실온 상태에 방치되어 있어야 한다고 했으며 온도가 1℃ 변할 때마다 0.3%정도의 정확성 오차를 일으킬 수 있다고 했다.


테스트 프로토콜과 관찰 내용
피펫을 보정하는 표준 온도인 20℃에서 4℃와 40℃ 각각의 증류수를 연속적으로 피펫팅하면서 시료 부피를 비교하는 테스트 프로토콜을 개발하였다. 20℃에서 Pipetman P100(20-100uL)에 GilsonDiamond Tip D200을 끼워 4℃와 40℃ 각각의 증류수를 팁을 교체하지 않고 연속적으로 10회 측정을 했다. 처음 4℃ 시료를 흡입했을 때 일반적인 환경에서 얻어진 결과보다 항상 많은 부피가 배출되었고, 반대로 처음 40℃ 시료를 흡입했을 때에는 기대치보다 적은 부피가 배출되었다. 하지만 4℃와 40℃ 시료 모두가 두 번째 피펫팅부터는 반대 현상이 관찰되었다.(Figure 1)

계통오차는 부피 규격에서 ± 4-9배 정도가 발생했다.

처음 4℃ 증류수를 흡입했을 때 증류수와 접촉한 공기쿠션의 온도가 감소하게 되므로 공기가 수축한다.(Figure2, cycle1)


증류수와 공기쿠션은 일정한 부피를 공유하고 있으므로 흡입된 부피는 일반적인 조건일 때보다 높다.(Vtotal=V공기쿠션+V시료)
두 번째 흡입과정에서는 공기쿠션이 처음 흡입 시 차가운 시료와 접촉한 팁 벽면의 낮은 온도 구역에서 액체와 전혀 접촉이 되지 않은 팁 홀더의 미지근한 영역으로 옮겨가게 된다.(Figure2, cycle2) 결과적으로 공기쿠션의 온도가 상승하면서 기체가 팽창하게 된다. 이는 처음 과정에서 우리가 관찰한 것과 정 반대 현상이다. 세 번째, 네 번째 피펫팅 사이클 조건은 두 번째 피펫팅 사이클과 질적으로 유사하며 결과는 다소 낮다.(Figure2, cycle3)


처음 40℃ 증류수를 흡입했을 때 증류수와 접촉한 공기쿠션의 온도가 상승하므로 공기 부피는 팽창한다. 결과적으로 배출된 시료 부피는 일반적인 조건일 때보다 적다. 두 번째 흡입과정에서는 공기쿠션이 처음 흡입 시 뜨거운 시료와 접촉한 팁 벽면의 높은 온도 구역에서 팁 홀더의 미지근한 영역으로 옮겨가게 된다. 결과적으로 공기쿠션의 온도는 하강하고 기체가 수축하면서 예상했던 결과보다 높은 양이 배출된다.

세 번째 사이클부터는 배출된 부피가 차가운 시료에서는 일반 값보다 낮은 상태에서 안정화가 되고, 차가운 시료에서는 높은 값으로 안정화가 되고 있지만 다소 변동이 있다. 이는 제조업체의 정밀성 규격에서 재현성 있는 수치가 얻어질 수 없다는 것을 보여주는 것이다. (Figure 1) 우리가 찾아낸 결과에 의하면 시료 온도와 20℃의 온도 차이 당 0.1-0.2% 정도의 정확성(계통오차) 오차가 발생하고 온도 범위가 넓어질수록 무게 오차 또한 커지게 된다. 즉, 실온 20℃에서 40℃ 시료를 측정할 경우 4% 오차가 발생하는 것이다.


추천사항
액체 시료와 피펫을 실온에서 평형을 이룰 수 있도록 추천한다. 만약 이것이 불가능하다면 실험자는 온도에 의한 오차를 상쇄시킬 만한 테크닉을 이용해야 한다. 그 중 하나가 바로 팁을 전처리하지 않고 계속 교체하는 것이다. Figure 1에서 볼 수 있듯이 Cycle 1 이후 두번째 결과부터는 허용치 기준에서 많이 벗어난다. Cycle 1의 오차는 ISO 8655 규격에서 정의 했듯이 온도와 관계없이 팁 전처리를 생략했을 경우 발생하는 2%의 오차와 견줄 수 있을 정도이다. Gilson이 이런 테크닉을 항시 추천하는 것은 아니다. 일반적인 경우 시료를 흡입하기 전에 3-4번 정도 시료를 흡입, 배출하는 팁 전처리 과정을 강력하게 추천한다. 이렇듯 특별한 경우에서 추천한 테크닉은 정확성이 떨어짐에도 불구하고 재현성을 높이기 위하여 예외적으로 허용하는 것이고 ELISA 또는 PCR과 같이 반복 분주형 피펫팅 태스크를 사용하는 가장 일반적인 실험 프로토콜에서는 이 테크닉이 중요한 인자가 될 것이다.


완벽한 실험 데이터를 특히 추구하는 연구원들은 직접치환 방식 피펫(Positive displacement pipette)을 사용할 수 있다.


이 피펫을 사용하면 실온 이상 또는 이하의 시료도 정확하고 정밀하게 작업할 수 있고 변동하는 양상도 피할 수 있다. Gilson MicromanⓇ 직접 치환 방식 피펫은 일회용 캐필러리와 피스톤을 사용하여 피스톤과 시료 사이의 공기 공간을 제거했기 때문에 흡입한 시료를 피펫 내부로부터 완전히 분리한다. MicromanⓇ을 이용하는 장점은 시료의 온도와 관계없이 정확성과 정밀성을 일정하게 유지할 수 있다는 것과 예외적인 특별한 피펫팅 테크닉을 사용하지 않아도 된다는 것이다. (Figure 3) DNase와 RNase의 불활성화가 4℃에서 이루어지는 유전 물질들을 다루는 생명공학 연구자들이나 혈청과 같은 생물학적 물질들을 인체 온도에서 다루는 진단검사학자들은 액체 시료온도가 피펫 온도랑 평형이 될 때를 기다릴 수 없다. 이처럼 온도와 상관없이 완벽한 결과가 필요할 때 Gilson은 MicromanⓇ과 같은 직접치환방식 피펫을 사용하여 이 분들이 최상의 부피 성능을 얻을 수 있도록 추천하는 바다.


Reference(참고문헌): Gilson Application Note.
Data Services(자료제공): KAISCO
The Person in Charge(담당자): An Hyesook
Maker(제조사): Gilson
e-mail(이메일):
kaisco1@kaisco.co.kr
Country of Origin(원산지): France
Model Name(모델명): Pipetman

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