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HPLC에서 Carryover를 최소화시키는 방법
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작성자 : 사이언스21 | 조회: 10 | 날짜: 2019-05-08 17:17:43

HPLC에서 Carryover를 최소화시키는 방법


시료들의 농도는 저마다 제각각일 수 있다. 농도가 낮은 시료의 경우 검출될 정도는 아니지만, 농도가 높은 시료와 비슷한 시료 잔류가 있을 수 있다. 그러나 시료 잔류(Carryover) 여부는 농도가 높은 시료를 주입한 후에 Blank 시료를 주입했을 때만 확인이 가능하고 이는 어느정도까지는 항상 존재할 가능성이 있다. 시료의 용해도, 농도, 부피, 매트릭스, Injection probe, Transfer tubing, Rinse solvent, Injection port, Injection valve, Injection protocol, 그리고 배관(Plumbing) 등이 모두 시료 잔류에 영향을 줄 수 있다. 시료 잔류량을 줄이기 위해서는 이러한 요소들을 매우 면밀히 조사해야 한다. 시료 잔류에 영향을 주는 이 요소들을 잘 알고 조절하면 상당 수준의 시료 잔류를 줄일 수 있다. 또한 Gilson GX-281Liquid Handler의 경우 Injection port를 거치지 않고 직접 시료를 Sample loop로 보내어 주입하는 Direct-Inject 기술을 도입하여 시료 잔류량을 극소화 시키고자 노력하고 있다.


시료 잔류(Carryover)를 줄이기 위한 시료 선택법
시료, 시료 매트릭스, 그리고 시료 농도 모두가 시료 잔류에 영향을 줄 수 있다. 당신이 사용할 시료와 매트릭스를 모두 즉시 용해시킬 수 있는 시료 용매를 선택해야 한다. 즉시 용해되는 시료는 Injection valve, Injection probe, 그리고 튜빙에서 즉시 세척될 수 있다. 만약 사용할 시료가 잘 녹지 않는다면 시료 잔류를 피하기 위하여 Probe, Transfer tubing, Injection port, 그리고 Injection valve를 매우 강력하게 세척해야 한다. 이를 위해서는 별도의 Advanced rinse protocols를 만들어 이용해야 한다.


시료 잔류(Carryover)를 줄이기 위한 최적의 Rinse/Injection 과정

시료 매트릭스는 변화될 수 없지만 세척 용매(Rinse solvent)는 용해도에 따라서 최적화될 수 있다. 세척 용매는 시스템 이동상과 맞아야하며 크로마토그래피 분리에 영향을 주지 말아야 한다. Mass 스펙트럼 검출을 이용할 때에는 세척 용매가 이온화 간섭을 일으키지 말아야 한다. Injection과 Rinse 과정을 최적화하면 시스템에서 시료 잔류를 줄이는데 도움이 될 것이다. Injection port를 세척한 후에 Probe를 Flowing rinse station으로 이동시켜 10mL/min의 속도로 Syringe volume의 75% 되는 양을 세 번 흡입하고 분배하면서 Probe를 세척한다. Probe를 Bi-directional flow-through rinse 방식으로 세척하면 일반적인 세척 과정으로 실행했을 때 보다 상당하게 시료 잔류량을 줄일 수 있다. System software에 들어 있는 일반 Rinse 과정은 Reservoir에 있는 용액을 한 방향으로 흘려 세척한다. Bi-directional rinse를 하기 위해서는 Flow-through rinse station과 정량펌프와 같은 External pumping system이 시스템과 함께 설치되어야 한다.

또 다른 방법으로는 1개 이상의 다양한 용매를 복합적으로 사용하여세척하여 시료 잔류를 줄일 수 있다. 선택된 용매들은 서로 섞일 수 있어야 하고 염(Salt)을 형성하는 반응을 해서는 안 된다. 2개의 용매로 세척을 하려면 Dual syringe pump와 Plumbing 악세사리, 그리고 Custom protocol이 필요하다. (Figure 1)

만약 Injection port가 오염되었다면 강력한 세척 과정이 요구된다.

오염된 Injection port를 세척하기 위해서는 Probe를 Rinse station으로 옮긴 후 최소 10번 이상 Standard rinse를 반복해야 한다. 그다음 Probe를 Injection port로 옮겨서 Probe를 올렸다가 내렸다가 하면서 Injection port를 10번 Rinse 시킨다. Port의 오염을 완벽하게 제거하기 위해서는 수동으로 다른 용매를 사용해서 세척해 줄 필요가 있을 수있다.
Injection 과정 또한 시료 잔류에 중요한 영향을 준다. Injection 과정에서는 시료에 담가질 Probe의 깊이와 시료와 Injection port에서 Probe가 내려왔다가 올라가는 일련의 Event를 정해야 하고 Rinse 부피와 Rinse dispense 속도를 설정한다. Probe가 시료 안으로 너무 깊게 내려가면 Probe를 불필요하게 오염시킬 수 있는 반면 너무 높이 올리면 Rinse station 안으로 Probe가 충분히 들어가지 않아서 세척 과정이 실행되지 않으므로 오염이 발생한다.
Probe를 Injection port에서 불필요하게 올렸다가 내리게 되면 시료 잔류를 10배 증가시킬 수 있다. 일단 Probe가 Injection port로 들어가면 Probe는 Rinse 될 때까지 Injection port에서 제거되면 안된다.


Injection port는 Calibrated tubing 부피의 1.5배 부피로 세척되어야 한다. Rinsing above the injection port seal을 추가로 실행하면 Probe와 접촉하여 전달되는 Injection port의 오염을 제거하는데 도움이 될 수 있다.
시료가 Injection loop 안에 머무르는 시간도 시료 잔류에 영향을 줄 수 있다. Single injection Injection module을 사용할 때에는 일반적으로 이러한 문제는 발생하지 않지만 Multiple Injection module을 사용할 경우에는 Wait time을 최소로 해야 한다. 시료가 Loop를 통해서 빨리 지나갈수록 다음 Injection으로 넘어가는 시간은 줄어들게 된다. 연속 Injection은 7번째와 8번째 Injection에서는 엄청난 양의 시료 잔류를 불러일으킬 수 있다. Multiple injection module을 사용할 때에는 일반 Serial injection 대신에 Serial injection을 수정하여 실행해야 한다.


Rheodyne LabPro의 부록을 보면 각각의 밸브에 일정한 흐름을 줄 수 있는 이상적인 유속이 제시되어 있으므로 도움이 될 수 있을 것이다. 이는 시료가 Loop에 머무르는 시간이 감소시킬 수 있어서 시료 잔류 또한 감소하게 될 것이다. 아래와 같은 부가적인 과정을 Injection 과정에 추가하면 시료 잔류를 더욱더 감소시킬 수 있다.


① 시료를 Vial에서 흡입한 후에 Probe의 외벽에 남아있는 시료를 제거하기 위하여 Probe를 용매가 담겨진 튜브나 Flowing rinse station에 담근다. 이때 Probe의 외벽이 세척될 것이고 Injection port seal은 오염되지 않을 것이다. 이 과정은 단 몇 초만 더 할애하면 실행할 수 있으며 몇몇 응용에서 시료 잔류를 현저히 감소시킬 수 있다. 이와 다른 방법으로서 1개 이상의 복합 용매로 세척을 하는 법도 있는데 이 또한 시료 잔류를 상당히 감소시킨다. (이때 사용되는 용매는 서로 섞여야 하고 염(Salt)을 형성하는 반응을 일으켜서는 안된다) 2개의 용매로 세척을 하려면 Dual syringe pump와 Plumbing 악세사리, 그리고 Custom protocol이 필요하다.


② Injection port의 Seal 아랫부분을 세척한 후에 윗부분을 세척하면 Seal과 접촉한 후에 Probe에 남아있는 대부분의 시료를 제거할 수 있다. Above seal rinse protocol은 다음 장에 과정을 소개할 것이다. 오염을 제거하기 위하여 1번 이상의 Aspirate/Dispense 과정을 반복하는 것이 필요하다.


시료 잔류(Carryover)를 줄이기 위한 Probe 선택법
Probe의 내경과 외경은 시료가 분출된 후에 Probe이 내, 외벽에 부착되는 시료의 양에 영향을 준다.
일정한 내경을 가진 Probe를 사용하면 Probe 내벽에 부착되는 시료의 양을 줄이는데 도움이 된다. 실험할 때 내경과 외경이 될 수 있는 한 가장 작고 시료나 시료 매트릭스에 대한 친화성이 없는 재질로 된 Probe를 선택해야 한다. 그리고 임의의 조건에서 시료 잔류를 2배로 증가시킬 수 있는 Constricting tip 형태의 Probe 사용을 가급적 피해야 한다. (Figure 2, Table 1 참고)

Bi-directional rinse를 이용하면 Constricted tip probe를 사용하여 발생한 시료 잔류를 줄일 수 있다. Bi-directional rinse는 용매가 담겨진 용기로부터 용매를 흡입, 분출하거나 Flow-through rinse station이 필요하고 두 방법 모두 Custom protocol을 써야 한다.
사용할 Injection port에서 Dead volume의 양이 가장 작은 Probe를 선택한다. Injection port는 Probe 중 직경이 가장 큰 곳 주위를 밀폐하도록 만들어졌다. 따라서 Constricting tip probe는 외경이 일정한 Probe에 비하여 Dead volume이 많다. (Figure 3) Injection port에서 Probe 높이를 잘못 조절해도 시료 잔류가 증가한다. 적절한 Probe 높이는Injection port 바닥에서 1mm 정도 위로 올라가는 것이다. Injection Module에서 Injection port 바닥에서 Injection port seal 위까지 전체 공간은 약 3mm이다. Probe가 Seal 바로 아래, 즉 Injection port 바닥에서 3mm 위에 있다면 시료 잔류는 증가하게 될 것이다. (Figure 4)

Probe의 선택을 잘하고 깊이 조절을 최적 조건으로 맞춘다면 시료 잔류는 감소시킬 수 있다. 밀폐된 바이알을 사용할 경우 Probe를 바이알에서 꺼낼 때 Probe가 닦이게 되므로 외벽에 부착된 시료에 의하여 생긴 시료 잔류는 감소될 수 있다. 또한 Probe가 Injection port로 이동하기 전에 Probe를 용매에 담가주면 외벽에 묻어 있는 시료에 의한 시료 잔류 오염 우려를 제거하는데 도움이 된다. 실험에 적합한 Probe를 주의를 기울여 선택하고 Injection 요소들을 최적화시켜 주면 Probe에서 비롯된 시료 잔류로 인한 오염은 무시할 정도의 양까지 줄일 수 있다.


시료 잔류(Carryover)를 줄이기 위한 배관(Plumbing)법
Injection port와 Injection valve 사이의 배관 연결은 시료 잔류에 중요한 영향을 준다. Injection port와 Injection valve 사이의 배관을 연결할때 Ferrule이 적절한 깊이로 Tubing에 끼워지지 않으면 Dead space나 필요 없는 부피 공간이 증가하게 될 것이고 시료 잔류에 상당한 영향을 미치게 될 것이다. (Figure 5) Injection loop에서 튜빙에 제대로 끼워지지 않은 Ferrule은 10배 정도 시료 잔류를 증가시킬 수 있다. Calibrated injection port tubing 또한 시료 잔류를 최소화 시킬 수 있도록 제대로 끼워져야 한다. (Figure 6, 7)


Fitting이 제대로 끼워지지 않아서 야기되는 시료 잔류를 감소시키기 위해서는 먼저 Nut와 Ferrule을 제거한다. 만약 당신이 스테인레스 튜빙을 사용하고 있다면 약 0.75인치(19mm) 정도를 튜빙에서 잘라내야 한다. PEEK 튜빙을 사용할 경우에는 약 0.25(6mm)를 자른다. 새로운 Ferrule을 설치할 때에는 Ferrule 끝으로 Tubing이 4mm(0.16인치) 정도 노출되게 남겨둔다. 너트를 끼울 때 튜빙을 Valve port 뒤쪽으로 밀어 넣는다. 모든 Ferrule들을 적절한 깊이로 확실히 끼우기 위해서는 주의를 기울여야 한다.
Injection valve에서 나오는 Waste line의 위치가 시료 잔류에 영향을 줄 수도 있다. Waste tubing의 Outlet이 Injection valve의 Waste port보다 낮게 위치했는지 확인해본다. 튜빙이 불필요하게 굽혀지지 않도록 주의한다. Waste tubing은 직선으로 아래쪽으로 기울어져 있어야 한다.
Injection valve의 유지 보수 또한 시료 잔류에 영향을 준다. Rotor seal이 오래되거나 닳게 되면 누수는 없을지라도 시료 잔류로 인한 교차 오염의 위험도가 커지고 RSD가 증가한다. Rotor seal이 닳거나 긁히게 되면 시료 잔류가 10배 증가할 수 있다. Rotor seal의 재질은 PEEK, Tefzel, 그리고 Vespel 중에서 선택할 수 있다. 시료에 대한 친화력이 없거나 있어도 극히 적은 재질을 선택해야 한다. 어떤 실험의 경우에는 재질을 선택해야 할 필요가 있을 수 있다.


시료 잔류는 한 가지 원인에 의하여 비롯되지 않는다. 시료, Probe, Injection port, 배관 연결, 또는 Rinse 용매를 선택하는데 있어서 시료 잔류가 비롯될 수 있음을 지켜볼 수 있었다. 이러한 조건들이 좋지 않은 상태로 변경되는 것은 사소하게 여겨질 수 있지만 상당한 수준까지 시료 잔류량을 증가시킬 수 있다. 여기에 쓰인 모든 조건에 세심한 주의를 기울이면 시료 잔류에 의한 교차 오염을 줄일 수 있을 것이다. 시료 잔류량이 2%보다 크면 장비 하드웨어나 Injection 과정에 뭔가 중요한 결점이 있다고 봐야 한다. Injection과 분석을 성공적으로 마치기 위하여 시료 잔류를 없앨 필요는 없다. 그러나 Assay에 간섭을 일으키지 않고 최소 검출한계를 낮추기 위해서는 시료 잔류가 감소되어야 한다.


0.1~0.02% 사이의 시료 잔류는 허용될 수 있고 일반적인 Routine operation에서 이 범위가 지켜져야 한다. 조금 더 주의를 쏟게 되면 시료 잔류량을 0.005% 이하로 내릴 수 있다. 이렇게 하려면 시료 주입에 걸리는 시간은 약간 증가하겠지만 크로마토그래피 분리 시간이 2분 이상이라면 이 정도의 시간이 더 걸리는 것은 무시할 수 있을 것이다.
이번 연구는 Probe나 튜빙, Injection port seal, 그리고 Injection rotor seal에 대한 시료의 친화력 때문에 발생하는 시료 잔류에 대해서는 시행되지 않았다. 이는 하나 이상의 하드웨어 부속품 재질을 변화시켜야 할 것이다. 시료 잔류를 감소시키는 해결책은 사용하는 시료가 최적의 조건에서 분석될 수 있게 할 것이다.


Troubleshooting
1. 시료 잔류가 0.02% 이상
• 시료가 Rinse 용매에 충분히 용해되지 않음 - Dual solvent rinse 설치를 시도하거나 시료가 잘 녹을 수 있는 용매로 교환.
• 시료가 Probe, Transfer tubing, Injection port, 그리고 Rotor seal에 친화력이 있음 - Rotor seal 종류를 Vespel이나 Tefzel, 또는 PEEK로 교환. 그러나 이 시료를 예전에도 시스템에서 작업했다면 Rotor seal 종류를 교환하지 말아야 한다.
•Injector rotor seal이 긁히거나 손상 - 의심할 여지 없이 교환.
• Ferrule이 Injection valve에 제대로 끼워지지 않음 - Injection valve에 Sample loop를 연결하는 배관과 Injection valve와 컬럼 사이의 배관 연결은 완벽해야 한다. 불확실하다면 모든 연결 Fitting을 빼고 새 Ferrule로 교체한다. 튜빙을 Port 뒤쪽으로 밀어 넣는다. 일단 튜빙의 위치가 잡히면 Port 뒤와 반대쪽으로 튜빙을 단단히 잡으면서 Ferrule과 Nut를 Injection port 안으로 밀어 넣는다.
• Injection port 내부의 Probe 깊이가 적절하지 않음 - Injection port 내부에서 Probe 깊이는 Injection port 바닥에서 위로 약 1.0 ±0.5mm와 있어야 한다. Injection port 내부의 Probe 깊이를 체크하기 위하여 기기의 전원을 끈 다음에 수동으로 Injection port의 바닥 쪽으로 Probe를 내려 본다.
Z-arm과 연결된 Probe holder의 위치를 표시하고 난 후 기기의 전원을 켜고 컨트롤 소프트웨어로 Probe 위치를 Injection port까지 움직인다. Probe holder의 위치가 표시한 지점에서 1mm 정도 위에 있는지 확인한다. 만약 그렇지 않다면 Clamp 높이를 조절해야 한다. (Figure 9)


2. 시료 잔류가 1% 이상
• 시료가 Rinse 용매에 녹지 않을 수 있으므로 매우 용해도가 큰 용매로 교체.
• 시료가 Probe나 Transfer tubing, Injection port, 또는 Rotor seal에 친화력을 가질 수 있음.
• Probe 내경이 흡입되는 시료 부피에 비하여 너무 큰 경향이 있음 - 작은 내경으로 교체.
• Probe가 Constricted tip이라서 시료가 적절하게 세척되지 않음 - 추천된 Probe로 교체.
• Rotor seal이 긁힘 - 의심할 여지 없이 교체, 현재 Vespel 을 사용하고 있다면 Tefzel 또는 PEEK로 교체. 그러나 이 시료를 예전에도 시스템에서 작업했다면 Rotor seal 종류를 교환하지 말아야 한다.
• Injection port 내부의 Probe 깊이가 적절하지 않음 - Injection port 내부에서 Probe 깊이는 Injection port 바닥에서 위로 약 1.0 ±0.5mm 와있어야 한다. 앞에서 설명한 것처럼 Probe 깊이를 적당하게 맞춰야 함.
• Injection valve에 Sample loop를 연결하는 배관과 Injection valve와 컬럼 사이의 배관 연결은 완벽해야 한다. 만약 그렇지 못하다면 앞에서 설명한 대로 다시 끼워야 함.
• Injection protocol을 재검토 - Injection port rinse volume은 Calibrated tubing 부피의 1.5배 정도가 필요하다. Above seal rinse를 포함시켜야 하고 Probe를 injection port로 이동시키기 전에 용매에 Probe를 담근다. Probe rinse 부피와 분출 속도를 증가시키거나 Syringe pump를 이용하여 세척 용매를 2가지로 사용해 본다.


3. 시료 잔류가 5% 이상
• Probe 막힘 - Probe를 뚫거나 교체.
• Calibrated tubing이나 Injection valve가 막히거나 Fitting이 제대로 끼워지지 않음 - Calibrated tubing을 빼서 교체하고 Injection valve를 뽑는다. 지시 내용을 참고하여 Fitting을 제대로 장착한다.
• Injection port seal이 긁혔거나 제대로 맞춰지지 않음 - Injection port seal을 제거한 후에 다시 넣거나 교체.
• Injection port 내부의 Probe 깊이가 적절하지 않음 - Injection port 내부에서 Probe 깊이는 Injection port 바닥에서 위로 약 1.0 ±0.5mm와 있어야 한다. 앞에서 설명한 것처럼 Probe 깊이를 적당하게 맞춰야 함.
• 시료가 Rinse 용매에 녹지 않을 수 있으므로 매우 용해도가 큰 용매로 교체.
• 시린지 펌프의 밸브가 제대로 스위치 되지 않음 - 기술 지원부로 문의.
• Syringe probe 연결이 느슨해졌거나 Syringe 누수 - 필요한 경우 모든 배관 연결을 체크하고 조여 준다. 시린지에 누수가 있으면 교체해야 함.
• Injection protocol이 최적화되지 않음 - 이 논문에서 제시한 대로 Rinse/Injection 프로토콜을 최적화시킴.
• 용매 오염 - 모든 용매 교체.


Reference(참고문헌): Gilson Application Note.
Data Services(자료제공): KAISCO
The Person in Charge(담당자): An Hyesook
Maker(제조사): Gilson.
e-mail(이메일):
kaisco1@kaisco.co.kr
Country of Origin(원산지): U.S.A
Model Name(모델명): GX-281 Preparative HPLC System


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