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멀티채널 피펫팅 시스템을 이용한 Coomassie(Bradford) Protein Assay 자동화
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작성자 : 사이언스21 | 조회: 28 | 날짜: 2019-09-03 16:42:18

용액 내의 단백질 정량은 임상, 대학, 산업 분야 등에서 일반적으로 거쳐 가는 필수 단계다. Coomassie(Bradford) Protein Assay는 단백질과 Coomassie brilliant blue G-250 dye와의 결합을 이용하여 용액내의 단백질 농도를 결정하는 분광광도법이다.(Bradford, MM. 1976)

Coomassie dye는 단백질 농도가 증가할 때 갈색에서 파란색으로 스펙트럼 이동을 하는데 알부민 또는 감마 글로불린의 정량곡선과 비교하면서 미지의 농도가 결정된다. 단백질과 결합된 Coomassie dye의 최대흡수 파장은 595nm이다. 실험 방법은 BSA 단백질 표준용액을 연속 묽힘 한 후 Coomassie dye를 표준용액과 미지 시료에 첨가한다. 이번 Application에서 실행한 Bradford Assay는 PIPETMAX 268 benchtop pipetting system(Figure 1)을 이용하여 과정을 자동화했다.
단백질이 결합된 Coomassie의 흡광도는 Vmax® Kinetic Microplate Reader로 측정하였다. 올바른 실험 기기를 선택하는 것은 수동 방법을 자동화시키는데 있어서 결과 산출량과 데이터의 질을 최대로 높이기 위하여 매우 중요하다. 실험 결과에 보면 PIPETMAN M Multichannel과 PIPETMAN L을 이용한 수동법과의 성능 비교를 확인할 수 있다.

Figure 1. Bradford Assay에 이용한 PIPETMAX 268


실험 조건
96 well standard형과 Deep 마이크로플레이트를 사용하여 Bradford Assay를 수동, 자동화 방법으로 각각 수행했다. 수동 과정은 부피 잠금장치가 장착된 PIPETMAN L®과 전동 멀티피펫인 PIPETMAN M multichannel을 사용했다. 자동화 과정은 PIPETMAX 268을 사용했다. Bovine serum albumin(BSA) (2.5-25μg/mL) 표준용액 검정 곡선은 3번(수동 과정과 PIPETMAX) 반복해서 산출했다. 표준 검정 곡선과 미지의 단백질 시료에는 Coomassie 시료가 추가되었고 10분 동안 인큐베이션을 시켰다. 흡광도는 Vmax Kinetic Microplate Reader로 595nm에서 측정하였고 미지의 시료들은 표준 용액 곡선과 비교하여 단백질 농도를 구했다.


▶ 실험 기구
•PIPETMAN® L P200L
•PIPETMAN M Multichannel P8x200M
•PIPETMAN D200과 DL10 Tips
•PIPETMAX 268
•TRILUTION® Micro Software
•Vmax® Kinetic Microplate Reader(Molecular Devices)
•SoftMax® Pro 6.2 software


▶ 시료와 용매
• Coomassie(Bradford) Protein Assay Kit(Thermo Scientific P/N 23200)
• Coomassie reagent: Coomassie G-250 dye, Methanol, Phosphoric acid 그리고 Solubilizing agents in H2O
• Bovine serum albumin(BSA) stock at 2 mg/mL in 0.9% saline 그리고 0.05% sodium azide
• DI H2O -18 Megohm(Barnstead NANOpure® Infinity)


▶ 프로토콜
부피 범위가 300-500μL인 BSA 수용액(25, 20, 15, 10, 5, 2.5 and 0μg/mL)을 Deep 96 well plate에 넣어 표준 검정곡선을 생성했다. 표준용액과 미지의 단백질 시료에 Coomassie reagent를 각각 150uL 씩 추가해서 Final microplate를 만들고 실온에서 10분 동안 인큐베이션 했다. 흡광도는 595nm에서 Vmax Kinetic Microplate Reader를 이용하여 측정했다.


▶ Gilson TRILUTIONⓇ Micro 소프트웨어
Bradford Assay 자동화는 PIPETMAX로 시행되었고 이 기기는 TRILUTION Micro Software로 제어했다. Bradford Assay 자동화 방법에는 BSA 표준 곡선(0-25μg/mL)을 만드는 과정이 포함되어 있다.(Deep 96 well microplate 사용) The BSA 표준용액과 Coomassie reagent가 각각 150μL씩 Final microplate에 자동으로 분주된 후 혼합된다.(표준 용액은 3번 제조되었다) 10분 동안 인큐베이션 시킨 후 Final microplate를 꺼내어 Vmax Kinetic Microplate Reader로 옮겨 595nm에서 흡광도를 측정한다.


Figure 2.
A) PIPETMAX bed layout
B) Coomassie Transfer
C) PIPETMAX로 Bradford Assay를 한 후 만들어진 Standard 96 well microplate


실험 결과
PIPETMAX로 Bradford Assay를 한 결과 제조된 표준 용액의 평균 OD 값에 대해서 R2가 0.964로서 재현성 있는 데이터가 산출되었다. 자동화 Run time은 22분 26초였다. 표준 곡선은 Figure 3과 같다. 표준용액에 대한 평균 %CV 값은 표준 곡선 0~1.8%CV 범위 내에서 0.9% 이고 5개 시료에 대한 평균 %CV 값은 1.7%(n=8)이다.


Figure 3. Bradford Assay BSA 표준 곡선


수동으로 실험한 결과를 PIPETMAX와 비교해 보면 제조된 표준 용액의 평균 OD 값에 대해서 R2가 0.941이고 총 걸린 시간은 17분 7초였다.

표준 용액에 대한 평균 %CV 값은 표준 곡선 0~3.4%CV 범위 내에서 1%이고 5개 시료에 대한 평균 %CV 값은 1.4%(n=8)이다.
Bradford Assay는 단백질 농도를 정량하는데 사용되는 매우 보편적인 테크닉이다. 정성 분석을 위해 표준 용액과 시료 제조 Application을 자동화 할 때도 Table 1의 정량 데이터와 유사한 결과를 보여준다.
Bradford assay 자동화가 수동방법보다 1.3배의 시간이 소요되긴 하지만 반복적인 액체 시료 처리에서 벗어나고 잠재적인 오류 위험을 배제한다는 점을 고려해 볼 때 이 정도의 시간차는 합리적이라고 볼 수 있다.


Table 1: Bradford Assay 결과 비교 - PIPETMAX vs. 수동 방법


Reference(참고문헌): 1. Bradford, M.M., Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. 1976, Analytical Biochemistry, May 7, 72: 248-254.
                               2. Gilson Application CL0113
Data Services(자료제공): KAISCO
The Person in Charge(담당자): Hyesook An
Maker(제조사): Gilson Inc.
e-mail:
kaisco1@kaisco.co.kr
Country of Origin(원산지): U.S.A
Model Name(모델명): PIPETMAX



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